Приложение 1

 

Атомная и электронная структура активных центров металлопротеинов

 

Один из наиболее важных способов связывания металлических ионов – образование комплексов с макроциклическими лигандами, которые называются порфиринами. Это производные порфина и отличаются друг от друга расположением заместителей по периферии системы. В металлопорфиринах внутренние атомы водорода замещены металлическими ионами. Гемоглобин, миоглобин и цитохромы содержат протопорфирин IX (четыре метильные группы, две винильные группы и два остатка пропионовой кислоты). Протопорфирин образует «черырехзубчатые» комплексы с ионами таких металлов, как железо, магний, цинк, никель, кобальт и медь.

 

Основные функции железа в биологических системах – транспорт кислорода и участие в цепи переноса электрона. В этих случаях железо входит в структуру гема, который тесно связан с молекулой белка. Хелатный комплекс протопорфирина с Fe (II) называется протогемом или просто гемом, аналогичный комплекс с Fe (III) – гемин или гематин. В геме четыре лигандные группы порфирина образуют комплекс с железом, имеющий плоское строение, а оставшиеся пятая и шестая координационные связи железа расположены перпендикулярно плоскости порфиринового кольца [Коттон Ф., Уилксон Дж. 1979].

 

Гемоглобин

 

Основной функцией гемоглобина является связывание молекулярного кислорода и транспорт его по организму к органам и тканям. В результате соединения кислорода с гемом образуется оксигемоглобин (Hb–O₂), концентрация которого в крови зависит от парциального давления О₂. В мышцах кислород от оксигемоглобина переходит к миоглобину. Транспорт СО₂ в малой степени связан с гемоглобином. Конкурентное связывание с гемом таких лигандов как CO или NO снижает функциональные способности гемоглобина, что приводит к гипоксии клеток организма.

 

Цитохромы

 

Эти гем – белки играют роль переносчиков электронов. Они принимают электрон от вещества, являющегося немного боле сильным восстанавливающим агентом, и передают его более сильному окислителю. В митохондриях клеток высших животных и растений идентифицировано пять цитохромов (далее цх): b, с, с₁, а, а₃, в эндоплазматическом ретикулуме - b₅. Известны также и другие геминовые ферменты – пероксидаза и каталаза (разрушают перекись водорода).

 

Последовательность реакций дыхательной цепи начинается окислением восстановленного никотинамид адениндинуклеотида (НАДН₂). В процессе участвует несколько редокс–центров НАДН₂ – КоQ-редуктазного комплекса, а именно флавинмононуклеотид (ФМН), и по-видимому, пять железосерных кластеров (FeS_I 1a, FeS_I 1b, FeS_I 2, FeS_I 3, FeS_I  4). НАДН₂ – КоQ-редуктаза восстанавливает КоQ. Полученный КоQН₂ окисляется системой Q-цикла, включающей FeS-кластер комплекса III (FeSiii) и два гема цитохрома b (высокопотенциальный b_h  и низкопотенциальный b_i ). Непосредственным акцептором электронов для КоQН₂ служит FeSiii. От него электроны поступают на цх с₁ и далее на цх с. Последний используется как восстановитель конечного фермента дыхательной цепи и цитохромоксидазы, имеющей в своем составе два гема (а и а₃) и два атома Cu [Ленинджер, 1974].   Окисленная форма системы цх а+а₃ может принимать электроны от восстановленного цх с₁, который  вновь окисляется, но уже молекулярным кислородом. Система цх а+а₃ состоит из шести субъединиц, каждая из которых содержит один гем А и один атом меди. Две субъединицы относятся к цх а и не могут взаимодействовать с кислородом, остальные к цх а₃ и с кислородом взаимодействуют.

 

Имеются данные, что молекулы–переносчики электронов, сгруппированы в надмолекулярные комплексы - дыхательные ансамбли. Они содержат строго определенное число молекул каждого из переносчиков и встроены в мембрану митохондрий. Переносчики, располагающиеся рядом в цепи переноса, ориентируются, по видимому, таким образом, что их простетические группы могут контактировать друг с другом благодаря определенным колебательным и вращательным движениям [Скулачев В. П., 1989]. Специфика ферментов – переносчиков электронов состоит в том, что эти весьма реактивные окислительно-восстановительные катализаторы зачастую специфичны не столько к структуре донора и акцептора электронов, сколько к их редокс-потенциалу. Искусственные акцепторы с более положительным, чем у фермента, потенциалом часто становятся окислителями фермента.

 

NO-синтаза

 

Синтаза оксида азота имеет много общего с системой цитохром Р-450 – Р-450-редуктаза, но отличается от нее, в частности, участием в катализе тетрагидробиоптерина. Катализируемое синтазой окисление аргинина до цитрулина и NO протекает с промежуточным образованием N—гидрокси-L-аргинина. Образование NO из N—гидрокси-L-аргинина представляет собой уникальную реакцию 3-электронного окисления азота [Fucuto J. M., 1996].

 

Негемовое железо

 

В некоторых белках, а именно железосерных кластерах (ферродоксинах) железо не включено в состав гемогруппы, а находится в иной форме. Эти белки имеют большой молекулярный вес 6000 – 12000. Содержат обычно от двух до восьми атомов железа на молекулу и столько же остатков цистеина, специфическим образом связанного с железом. Эти белки способны восстанавливаться ферментативным или химическим путем в результате одноэлектронного переноса. Они принимают участие в фотосинтезе и процессе фиксации азота [Ленинджер А., 1974].

 

Молекулярная структура гемопротеинов

 

Молекулы гемопротеинов это белки, построенные из сотен аминокислот. Чаще подобные структуры состоят из нескольких субьединиц как например молекула гемоглобина или цитохрома а. Отдельные участки белка имеют b-складчатое строение, а другие представляют собой a-спираль. Но активным центром такой огромной молекулы является гем, состоящий из 36 атомов. Именно его электронная и атомная структуры отражают лигандсвязывающую и электронтранспортную активность всей молекулы. Лишь несколько аминокислот, ковалентно связанных с углеродами, находящимися на периферии протопорфиринового кольца, а также аминокислоты, связанные непосредственно с железом гема имеют определенное влияние на степень функциональной активности гемопротеинов. Остальная же аминокислотная цепь благодаря водородным связям и силам гидрофобного взаимодействия поддерживает уникальную конформацию данной белковой молекулы, которая находится либо в цитоплазме клетки, либо встроена в клеточную мембрану.

 

Гемоглобин

 

В центре связывания лиганда молекулы гемоглобина, гем-группа присоединяется к белку за счет координации по атому азота His. Трансположение по отношению к гистидиновому азоту занято молекулой воды в не окисленном состоянии железа или молекулой кислорода  - в окисленном. Присоединение кислорода к одной из четырех гем-групп гемоглобина увеличивает константу связывания для следующей молекулы кислорода, что приводит к связыванию последующих молекул кислорода.

 

Миоглобин

 

Молекула гема как бы вставлена внутрь структуры миоглобина. При этом с водным окружением контактирует только ребро гема, погруженного в белок, как в своего рода корзину, образованную двумя a-спиралями и выстланную гидрофобными боковыми цепями аминокислот. Гем не имеет ковалентных связей с белком, удерживаясь нековалентными взаимодействиями. Всего насчитывается 80 межатомных контактов между белком и гемом, что обеспечивает достаточно прочное удерживание последнего.

 

Как в молекуле гемоглобина, так и в миоглобине с обеих сторон плоскости гема, «над» и «под» атомами железа, располагаются имидазольные кольца двух остатков гистидина (рис.1). Один занимает 8-ое положение в  a-спирали и наиболее приближенный к атому железа, называют проксимальным. Атом азота его имидазольного кольца находится в контакте с атомом железа, так что между ними образуется ковалентная связь. Другой остаток гистидина, занимающий седьмое положение в a-спирали, называют дистальным, так как он относительно удален от атома железа. Между ними есть свободное пространство, в котором и размещается молекула кислорода. При этом один из ее атомов непосредственно подходит к железу, другой – к имидазольному кольцу  дистального гистидина. Т. о., вокруг  двухвалентного железа гема пять координационных мест заняты атомами азота (4 –порфина, 5-ый – His), одно – кислородом. [Степанов В. М., 1996].

 

 

 

 

 

 

Пространство, в котором связывается молекула кислорода, не имеет, однако, постоянного выхода в окружающую миоглобин воду. Предполагают, что боковые группы остатка дистального гистидина и соседнего с ним аргинина могут занимать несколько разных положений, образуя своего рода «дверцу». Ее открытие позволяет молекуле кислорода  подойти к гему. Неясно, «дожидается» ли кислород случайного  открывания «дверцы» в результате тепловых колебаний или как-то его индуцирует. Очевидно, что динамика молекулы миоглобина играет существенную роль в его функции. В нормальных условиях в миоглобине и других глобинах при присоединении кислорода не происходит окисления железа. Судя по модельным опытам, это как-то связано с погружением комплекса гем-кислород в гидрофобную среду, каковой является окружение гема в глобинах. Если окисление происходит и железо переходит в трехвалентное состояние, то образуется ферримиоглобин, уже не способный функционировать. Место связывания кислорода в нем занято водой.

 

Аномальные гемоглобины (некоторые)

 

Гемоглобин Хаммерсмит: замена фенилаланина 42  в b-цепи не серин приводит к утрате весьма важного гидрофобного контакта с гемом, при этов в гидрофобное окружение гема вторгается гидрофильная группа, а вслед за ней вода. Это приводит к потере гема или нежелательному окислению желеа.

Гемоглобин Бостон: дистальный гистидин в a-спирали заманена на тирозин, фенольная группа которого образует ионную связь с ионом железа гема, не оставляя места для связывания молекуды кислорода [Бышевский А. Ш., Терсенов О. А., 1994]

 

При замене в результате направленного мутагенеза проксимального Нis 93 в миоглобине на Cys, он координирует с железом гемовой группы. У мутантов His 93 - Cys значительно повышается способность к гетеролитическому расщеплению О-О связи в гидропероксиде кумола. При замене дистального His 64  на Gly  или Val дистальная полость становится гидрофобной, при этом эффективность расщепления О-О практически не меняется, но затруднено вхождение в нее полярной молекулы Н₂О₂ [Watanabe Y. , 1996].

 

Цитохромы

 

Эти гем–белки играют роль переносчиков электронов. Они принимают электрон от вещества, являющегося немного боле сильным восстанавливающим агентом, и передают его более сильному окислителю. Специфика ферментов – переносчиков электронов состоит в том, что эти весьма реактивные окислительно-восстановительные катализаторы зачастую специфичны не столько к структуре донора и акцептора электронов, сколько к их редокс-потенциалу. Искусственные акцепторы с более положительным, чем у фермента, потенциалом часто становятся окислителями фермента [Скулачев В. П., 1989].

 

Хотя обычно считается, что на участке между НАД и КоQ осуществляется двухэлектронный перенос, а на участке между цх b и кислородом – одноэлектронный перенос, нельзя исключать и другие возможности. Имеются данные, что молекулы – переносчики электронов, сгруппированы в надмолекулярные комплексы - дыхательные ансамбли. Они содержат строго определенное число молекул каждого из переносчиков и встроены в мембрану митохондрий. Переносчики, располагающиеся рядом в цепи переноса, ориентируются, по-видимому, таким образом, что их простетические группы могут контактировать друг с другом благодаря определенным колебательным и вращательным движениям [Скулачев В. П., 1989, Ленинджер A., 1974].

 

В активном центре цитохромов атом железа также координирует атом азота имидазольного кольца с одной стороны от плоскости порфиринового цикла. Но в дополнение к этому он координирует с другой стороны атом серы аминокислотного остатка, который может находиться в разных частях белковой цепи. Поэтому потенциальная способность атома железа в цитохроме к связыванию кислорода подавлена [Коттон Ф., Уилксон Дж., 19791]. Почти во всех цитохромах пятое и шестое положение заняты R-группами определенных аминокислотных остатков белка и поэтому недоступны для связывания с такими лигандами, как кислород, окись углерода или цианид [Ленинджер А., 1974 ].

 

В цитохроме с железосодержащая протопорфириновая группа ковалентно связана с белком через тиоэфирные мостики между порфириновым кольцом и двумя остатками цистеина. Пятое и шестое положения железа заняты соответственно остатками гистидина и метионина (рис.2), вследствие чего цх с не может реагировать с кислородом или окисью углерода. В гемоглобине, миоглобине и цитохромах b и а, порфириновое кольцо ковалентно не связано с белком.

 

 

 

 

 

 

В цитохромах а+а₃ (цитохромоксидазы) вместо протопорфирина содержатся порфирин А, который отличатся от протопорфирина тем, что 1) вместо метильной группы в положении 8 имеет формильную группу, 2) не имеет метильной группы в положении 5, 3) имеет в положении 2 вместо винильной группы длинную гидрофобную 15-углеродную изопреноидную боковую цепь (рис.3). Предполагают, что пятое координационное положение железа занято аминогруппой, принадлежащей остатку аминосахара, входящего в состав белка [Ленинджер А., 1974 ]. Цх а₃  также как и гемоглобин может соединяться с окисью углерода, которая конкурирует с кислородом. Это ингибирование снимается видимым светом. Цианид и сероводород тоже способны ингибировать цх а+а_3. [Скулачев В. П., 1989].

 

 

 

 

В цитохроме b₅ оксигеназной редокс-цепи  железо гема как и в цитохромах электронтранспортной цепи связано координационными связями в 5-ом и 6-ом положениях с имидазолами гистидина (His 39 и His 63) [Карякин А. В., Арчаков А. И., 1981]. 

 

Гем цитохрома Р-450 располагается параллельно плоскости мембраны в которую встроен фермент. С консервативными участками последовательности связывают проявление спектральных и каталитических свойств. Они могут также определять взаимодействие цитохрома с мембраной. Предполагается, что именно цистеин является 5-ым аксиальным лигандом гема цитохрома Р-450. Исследования спектральных и каталитических свойств мутантных белков позволили выявить функциональную значимость аминокислот, формирующих микроокружение гема. Неполярные аминокислоты Phe-449, Leu-451, Gly-452, Ile-457, Gly-458 необходимы для встраивания гема в апофермент цитохрома Р450, а Arg-451 в мембранных цитохромах взаимодействует с пропионатом гема. Предполагается, что гистидин участвует в связывании субстратов, а Lys- 394, 402, 453, а также другие лизины 139, 144 и 251 могут быть центрами взаимодействия Р450 с другими белками-партнерами. Аминокислоты, содержащие гидроксильные группы, в частности Tyr-380, претендуют на роль 6-ого транстиолатного лиганда железа гема. Но наиболее вероятным кандидатом на эту роль является атом кислорода молекулы воды. В молекуле цитохрома Р450 из P. putida. гем расположен между двумя параллельными спиралями; с пропионовыми группами гема взаимодействуют остатки Arg-112, Arg-229 и His-335, другие аминокислоты, окружающие гем, неполярны: гем не выходит на поверхность молекулы. Наименьшее расстояние от поверхности до гема составляет около 0,8 нм. В связывании субстрата (камфоры) принимает участие гидроксильная группа остатка Tyr-96. Молекула субстрата располагается на расстоянии 0,4 нм над пиррольным кольцом A протопорфирина IX, в непосредственной близости от места связывания с СО. Кроме водородной связи с Tyr-96 в ориентации камфоры участвуют гидрофобные аминокислоты (рис.4). [Guengerich F.P., 2000]

 

 

 

 

 

Атомная и электронная структуры без лигандов и с ними

 

Гемоглобин, миоглобин

 

В дезоксигемоглобине железо находится в высокоспиновом состоянии и один из электронов занимает d_x2-y2-орбиталь, доли которой направлены прямо на четыре порфириновых атома азота. Присутствие электрона на этой орбитали приводит к эффективному увеличению радиуса атома железа в этом направлении и к росту отталкивания с неподеленными электронными парами атомов азота. В результате чего, атом железа, чтобы уменьшить это отталкивание, выходит из плоскости, образуемой атомами азота, на 0,7-0,8 Å. Но атом железа связан координационной связью также и с атомом азота His. Поэтому атом железа в дезоксигемоглобине приобретает конфигурацию квадратной пирамиды (рис. 5).

 

Если молекула кислорода присоединена к железу, то она занимает положение, противоположное атому азота имидазольного кольца His. Появление шестого лиганда изменяет силу поля лигандов, железо переходит в низкоспиновое состояние, в котором шесть d-электронов занимают орбитали d_xy, d_zx  и d_yz. Орбиталь d _x2-y2 становится вакантной, и описанный выше эффект отталкивания между порфириновыми атомами азота и электроном, занимавшим эту орбиталь пропадает. Поэтому атом железа вновь может вернуться в центр почти плоского порфиринового кольца и образовать октаэдрический комплекс.

 

При таком движении атом железа увлекает за собой и гистидиновый остаток боковой цепи, и амплитуда этого движения составляет примерно 0,75 Å . Смещение затем передается другим частям белковой цепи, в которую входи гистидин, в частности, происходит большой сдвиг фенольной боковой цепи, содержащей тирозин. А это в свою очередь вызывает различные смещения атомов в соседних субъединицах, что и оказывает влияние на способность к связыванию кислорода гем-группами в них. Так, движение атома железа гем-группы в одной субъединице гемоглобина действует как «спусковой механизм», который запускает в движение существенные структурные изменения в других субъединицах.

 

 

Нерешенный вопрос – строение группировки Fe – O₂. Возможны три варианта структуры. Наименее реально линейное строение (1). И таких структур еще не обнаруживалось. Боковое расположение должно быть таким же, как и в простых комплексах кислорода с другими металлами (2). Но наиболее вероятной кажется изогнутая структура (3).

 

 

Принято следующее, весьма огрубленное, описание цепи событий, сопровождающих присоединение молекулы кислорода к какой либо из субъединиц гемоглобина. Молекула кислорода проникает внутрь субъединицы и размещается между железом гема и имидазольной группой дистального гистидина, которая, видимо, образует с одним из атомов кислорода водородную связь. Присоединение кислорода изменяет электронное состояние атома железа, который до этого находился как  бы «над» плоскостью гема, а теперь смещается на 0,4 – 0,8 Å , приближаясь к кислороду и втягиваясь в плоскость порфиринового кольца. Это движение приводит к соответственному смещению имидазола проксимального гистидина, образующего с железом связь, близкую к ковалентной. Смещение имидазола далее вызывает смещение всего остатка  дистального гистидина и всей a-спирали в которой этот остаток расположен и т. д. Итак, присоединение кислорода к субъединице гемоглобина вызывает целую последовательность структурных изменений, распространяющихся от гема к периферии глобулы и смещающих ионизированные группы не ее поверхности.

 

Валентность железа в гемоглобине при присоединении или потере кислорода не меняется (II), а при действии феррицианида онa переходит в III. При этом образуется метгемоглобин и он не способен обратимо функционировать в качестве переносчика кислорода [Коттон Ф., Уилксон Дж., 1979; Степанов В. М., 1996].

 

Цитохромы

 

У цитохромов валентность обратимо изменяется, т. к. их истинная функция состоит в переносе электронов, а гемоглобина – в переносе лигандов (кислород). Окисленная форма системы цх а+а₃ (Fe III) может принимать электроны от восстановленного цх с, переходя в Fe II, которая  вновь окисляется в Fe III, но уже молекулярным кислородом. Система цх а+а₃ состоит из шести субъединиц, каждая из которых содержит один гем А и один атом меди. Две субъединицы относятся к цх а и не могут взаимодействовать с кислородом, остальные к цх а₃  и с кислородом взаимодействуют. Перенос электронов на кислород сопровождается превращением Cu (II) – Cu (I). Цх а_3,  также как и гемоглобин, может соединяться с окисью углерода, которая конкурирует с кислородом. Это ингибирование снимается видимым светом. Цианид и сероводород также ингибируют цх а+а_3.

 

Цианид, в отличие от О₂ и СО, связывается с Fe(II), лишь в незначительной степени изменяя электронную структуру гема, что означает отсутствие кооперативного связывания цианида в гемоглобине [Boffi A., Chiancone El., et al., 1997]. Но наиболее интересным лигандом гема является оксид азота, генерируемый в клетках при участии NO-синтазы.

 

Цитохром Р-450

 

На 1-ой стадии оксигеназного цикла (цикл а) происходит связывание субстратов с окисленной формой Р450 с образованием фермент-субстратных комплексов. При этом в зависимости от субстратов могут появляться три типа изменений оптических спектров: I, II и модифицированный II, характеризующиеся в дифференциальном спектре поглощения максимумом и минимумом при определенных длинах волн. (рис. 6).

 

Субстраты I типа взаимодействуют в основном с низкоспиновой формой Р450 и атом железа из шестикоординированного низкоспинового состояния переходит в пятикоординированное высокоспиновое состояние. В образовании комплексов I типа ведущую роль играют гидрофобные взаимодействия неполярных субстратов с активным центром фермента.

 

Комплексы типа II возникают в результате взаимодействия аминогруппы субстрата с атомом железа гема, находящимся либо в высокоспиновом, либо в низкоспиновом состояниях. При этом высокоспиновая форма железа переходит в низкоспиновую. Железо гема в таких комплексах находится в шестикоординированном состоянии, причем место связывания кислорода занято азотом субстрата.

 

Модифицированный тип II спектральных изменений является результатом взаимодействия гидроксильной группы субстрата с высокоспиновой формой железа. Скорость взаимодействия субстратов I типа с Р450, как правило, на порядок выше, чем II типа.

 

 

На 2-ой стадии монооксигеназного цикла происходит восстановление комплекса Р450-субстрат. Электрон для восстановления цитохрома Р450 поступает от NADPH-специфичного флавопротеина. На следующих стадиях происходит активация кислорода. Для этих стадий характерно последовательное образование окси- и пероксикомплексов Р450. Оксикомплекс Р450 способен диссоциировать с освобождением суперокисных радикалов, из которых в реакции дисмутации генерируется перекись водорода (цикл б). Восстановление оксикомплекса вторым электроном ведет к образованию двухэлектронновосстановленного пероксикомплекса. Считается, что эта стадия является лимитирующей в монооксигеназном цикле. При распаде пероксикомплекса генерируется перекись водорода (цикл в) и образуется реакционноспособная частица оксеноида (FeO) , содержащая шестиэлектронный атом кислорода, лигандированный трехвалентным железом. Кислородный атом из этой частицы может переноситься к С-Н-связи субстрата и внедряться в нее. В качестве другого механизма предлагается возможность ацилирования дистального атома кислорода, лигандированного на железе гема. Распад этого комплекса ведет к образованию надкислоты в активном центре Р450. Низкая реакционная способность надкислоты требует дополнительной активации  молекулы субстрата. Двухэлектронное восстановление оксеноида ведет к образованию воды из молекулы кислорода (цикл г). Вероятнее всего, единого механизма для реакций, катализируемых цитохромом Р450, не существует [Арчаков А.И., 2000].

 

NO-синтаза

 

В синтазе оксида азота субстраты связываются вблизи гема, который активирует О₂, необходимый для генерации NO и цитрулина из аргинина. Вместо O₂ гем может координировать с NO и СО. Показано, что эти лиганды также взаимодействуют с субстратами. Предполагается существование «открытой» и «закрытой» конформаций гемового пакета синтазы оксида азота [Rousseau D. L., 1996].

 

В отсутствие лигандов (аргинина и тетрагидробиоптерина) Fe(III)-форма оксигеназного домена находится в димерном состоянии. При насыщающих  концентрациях аргинина или тетрагидробиоптерина Fe гемовой группы частично или полностью переходит в высокоспиновое состояние. В этих условиях связывание СО с Fe(II)-формой  домена существенно затруднено. Однако эти лиганды почти не влияют на связывание NO. Первичные 6-координатные комплексы СО или NO с Fe(II)- гемом нестабильны и переходят в 5-координатные формы. Такой переход в случае NO происходит быстро, а с СО гораздо медленнее. Аргинин и тетрагидробиоптерин существенно влияют на связывание СО и NO с оксигеназным доменом фермента за счет изменения конформации белка [Abu-Soud H. M., Wu Ch., Ghosh D. K., et al., 1998].

 

Среди всех возможных лигандов гемопротеинов, оксиду азота стоит уделить особое внимание. Будучи синтезированной в активном центре NO-синтазы, молекула NO находится в устойчивом комплексе с железом гема, что приводит к обратимой инактивации фермента. Известно, что тиолы препятствуют автоингибированию NO-синтазы и способны взаимодействовать с NO с образованием тионитритов (нитрозотиолов) при катализе ионами переходных металлов [Недоспасов А. А., 1998].

 

Оксид азота с высоким сродством взаимодействует с железом гемового и негемового происхождения. Константа взаимодействия NO с гемоглобином в 100 раз выше чем для СО. NO способен связываться с гемовым железом (III) и восстанавливать его до (II). NO является высокоаффинным ингибитором многих оксидаз и оксигеназ связываясь вместо кислорода с гемами типа а (цитохромоксидаза E. Coli), b (каталаза, пероксидаза, триптофан – 2, 3, - диоксигеназа, цх Р-450), d1 (нитратредуктаза). Оксид азота связывается с белками, содержащими негемовое железо, с железосерными и медьсодержащими белками.

 

Показано образование ферри- и феррокомплекса микросомального и субмикросомального цитохрома Р-450 с NO. Установлено, что комплекс NO – P-450 нестабилен и подвергается превращению в комплекс, характеризующийся сигналом ЭПР, аналогичным P -420 – NO [Хаценко О., 1998].

 

NO взаимодействует не только с различными формами Hb, но и почти все клеточные металлопротеины  являются потенциальными мишенями NО [Henry Y., Guissani A., 1955]. Пероксинитритный анион ONOO^- влияет на активность дыхательной цепи митохондрий, ингибируя этот процесс [Okada Sh., Takehara Y., Yabuki M., et al., 1996], синтез АТФ и регуляцию мембранного потенциала. Действие NO на митохондрии необратимо, поэтому он играет существенную роль в регуляции функций этих органел [Lin Z., Miao M., Wang X., Zhu Ch., 1997]. Поскольку NO способен связываться с цитохромоксидазой и ингибировать перенос электронов, обсуждается возможность участия NO-синтазы в регуляции окислительного фосфорилирования [Bates T. E., Loesh A., Burnstick G., Clarc J. B., 1996]. Связывание NO с микросомальным Р-450 in vitro приводит к ингибированию активностей этих ферментов. NO может являться неспецифическим ингибитором всех Р-450, однако угнетение активности может быть выражено по- разному в отношении различных форм Р-450, что, вероятно, связано с различной доступностью гема для NO. С помощью электронного парамагнитного резонанса идентифицировали цх Р-450 и Р-420 как внутриклеточные мишени NO в печени мыши [Хаценко О., 1998].

 

Ингибирующее действие NO обусловлено его взаимодействием не только с гемопротеинами, но и со свободными SH-группами.

 

NO может действовать и как антиоксидант, взаимодействуя с анионом супероксида, гидроксильным радикалом  и перекисью водорода. Но при взаимодействии NO с супероксидом (О^2-) могут образоваться и токсические продукты – пероксинитрит, способный окислять тиоловые группы, инициировать перекисное окисление липидов (ПОЛ)  и повреждать основания ДНК. В итоге соотношение защитных и цитотоксических эффектов NO в определенной мере будет зависеть от внутриклеточного редокс-потенциала [Тэйлор Б. С., Аларсон Л. Х., Биллиар Т. Р., 1998].

 

NO может обратимо реагировать с ионами металлов, образуя комплексы (принято считать, что внешние электроны NO переходят на вакантные орбитали атомов металлов). Для s- и р-элементов эти комплексы обычно неустойчивы и существуют лишь при высоких концентрациях свободного NO, однако с переходными металлами известны исключительно стабильные комплексы. Считается, что взаимодействие p-разрыхляющей орбитали NO с d-орбиталями металла приводит к образованию новой гибридной орбитали, на которую приходят (как бы обратно) электроны металла.

 

Большинство нечетных метаболитов – ионы переходных металлов и их комплексы с органическими лигандами Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, V могут существовать в нескольких последовательных степенях окисления, энергии перехода между которыми часто невелики и сильно зависят от окружения. Образование ими комплексов с NO (независимо от устойчивости самих комплексов) может сопровождаться внутренним окислением-восстановлением. Так, NO образует комплекс с гемом – в случает Fe (II) он исключительно устойчив, но окисление железа до Fe (III) делает комплексообразование обратимым, причем комплекс представим в виде равновесных структур с железом (II) и (III).

 

При низких концентрациях NO ион металла часто оказывается одноэлектронным окислителем или реже восстановителем, позволяющим NO образовать четный продукт в реакции с обычным четным метаболитом. Следовательно, нитрит и тионитрит (нитрозолы) – известные четные метаболиты азота в степени окисления +3 – могут получаться одноэлектронным окислением NO ионом переходного металла без участия второй молекулы NO. Аналогично комплекс кислорода с гемоглобином в реакции с NO образует нитрат и метгемоглобин:

Hb (Fe) ²⁺  O₂  + NO = Hb (Fe) ³⁺  + NO ₃^- [Недоспасов А. А.; 1998].

 

Методом остановленной струи изучали связывание СО и NO с гемовой группой  оксигеназного домена синтазы оксида азота. Детально исследовано влияние аргинина и тетрагидробиоптерина на такое взамиодействие. В отсутствие этих лигандов Fe(III)-форма оксигеназного домена находится в димерном состоянии. При насыщающих  концентрациях аргинина или тетрагиюдробиоптерина Fe гемовой группы частично или полностью переходит в высокоспиновое состояние. В этих условиях связывание СО с Fe(II)-формой  домена существенно затруднено. Однако эти лиганды почти не влияют на связывание NO. Первичные 6-координатные комплексы СО или NO с Fe(II)- гемом нестабильны и переходят в 5-координатные формы. Такой переход в случае NO происходит  быстро, а с СО гораздо медленнее. Аргинин и тетрагидробиоптерин существенно влияют на связывание СО и NO с оксигеназным доменом фермента за счет изменения конформации белка.

 

Теоретическое квантово-химическое и молекулярно-динамическое исследование активных центров гемопротеинов

 

Адекватная интерпретация ряда экспериментальных данных требует изучения атомной и электронной структур активных центров гемопротеинов. Остается до конца не выясненной природа химической связи в этом классе объектов, ее изменение при переходе от одного производного к другому. Неясен также характер изменений электронной структуры гемов при образовании комплексов с простыми (О₂, NO) и сложными (различные аминокислоты) лигандами.

 

В последнее время в теоретической биохимии все большее распространение получают различные квантово-химические методы. Это связано с тем, что, с одной стороны, для молекулярно-биологических исследований начинают активно применятся  современные физические методы исследований, например – рентгеновская спектроскопия с использованием синхротронного излучения, а с другой – стороны, все больше внимание привлекают электронные аспекты процессов, протекающих в биологических системах. Эта тенденция в последние годы значительно усиливается в связи с изучением атомной и электронной структур активных центров белков, механизмов структур. электронного и протонного транспортов, ряда биологических окислительно-восстановительных реакций и ряда других процессов.

 

Наиболее подходящими с теоретической точки зрения для изучения особенностей электронной структуры активных биологических центров являются квантово-химические методы. Они основаны на приближенном решении уравнения Шредингера  (здесь  - это полноэлектронная волновая функция системы, построенная из атомных орбиталей,  - полная энергия системы, а  - гамильтониан системы, состоящий из суммы операторов кинетической  и потенциальной  энергий) для молекул и их фрагментов. Это позволяет получать информацию об их молекулярных орбиталях и природе химической связи, равновесной атомной геометрии, спектроскопических и некоторых термодинамических характеристиках таких как теплота образования. Сейчас в квантовой химии наибольшее распространение получили различные варианты метода Хартри-Фока-Руттана. В этом методе волновая функция системы электронов и ядер, полностью описывающая их состояние, представлена в виде детерминанта  который составлен из отдельных молекулярных орбиталей системы . Сами же молекулярные орбитали  представляются в виде линейной комбинации атомных орбиталей , полученных ранее для электронов, находящихся на атомах, из которых состоит изучаемый объект. Коэффициенты  описывают вклады k-тых атомных орбиталей в i-тую молекулярную орбиталь. Метод Хартри-Фока-Рутаана называют методом МО ЛКАО (молекулярные орбитали – линейная комбинация атомных орбиталей). Подавляющее большинство версий метода МО ЛКАО являются вариационными. Это означает, что решение считается найденным тогда, когда получена минимальная энергия системы. Эта особенность, в частности, позволяет искать равновесную атомную структуру молекулярных объектов: для нее энергия системы должна быть минимальна. В ряде случаев квантово-химические методы позволяют с хорошей точностью (порядка 0.01 – 0.001 ккал/моль) вычислять теплоты образования исследуемых объектов, которые равны разности между теплотой образования отдельных атомов, входящих в систему и энергией атомизации, последняя вычисляется как разность полной энергии системы и энергии всех атомов.

 

В неэмпирическом варианте метода Хартри-Фока-Рутаана возникает необходимость вычисления большого количества различных интегралов. Это приводит к тому, что даже на современной вычислительной технике невозможно проводить расчеты электронной структуры больших молекулярных систем, содержащих атомы переходных элементов. Для того, чтобы облегчить решение подобных задач были предложены полуэмпирические версии метода Хартри-Фока-Рутаана, в которых часть подобных величин или априори считается равными нулю, или же параметризована с использованием или экспериментальных данных (к примеру, потенциалов ионизации), или результатов тестовых неэмпирических расчетов. Не смотря на то, что полуэмпирические квантово-химические методы огрубляют картину, они позволяют примерно на два порядка облегчить решение для больших молекулярных систем. Это дает возможность применять их для рассмотрения фрагментов биологических молекул.

 

Квантово-химические методы позволяют исследовать системы как с закрытыми электронными оболочками, так и с открытыми. Закрытой электронной оболочкой называется такая система, в которой все электроны спарены, а открытой – в которой есть неспаренные электроны. Примером систем с открытой электронной оболочкой служат свободные радикалы, некоторые комплексные соединения и простые молекулы (к примеру – молекула О₂, у которой есть два неспаренных электрона). Для изучения систем с открытой электронной оболочкой применяется ограниченный метод Хартри-Фока (в английской аббревиатуре – RHF), а для открытой оболочки – неограниченный метод Хартри-Фока (UHF). Эти методы отличаются тем, что в методе RHF считается, что орбитали со спином вниз и со спином вверх эквивалентны, так как количество электронов с противоположными спинами равны и, следовательно, суммарный спин равен нулю. В случае, когда у рассматриваемой системы открытая электронная оболочка, уже невозможно считать, что орбитали со спином вверх и со спином вниз эквивалентны. Это требует решения системы для обеих спиновых подсистем по отдельности, что усложняет квантово-химический расчет.

 

Подавляющее большинство современных физических методов исследования вещества, которыми пользуются при определении структуры и свойств биологических объектов, требуют для себя низких (порядка 77К, температуры кипения жидкого азота) температур. Зачастую, для подобного рода объектов, такой подход не адекватен, так как при этом происходит достаточно серьезные изменения в атомном строении вещества за счет подавления внутримолекулярных тепловых колебаний и фазовых переходов под действие температуры (к примеру, кристаллизации гидратной оболочки белковой молекулы и пр.). Более того, большинство биологических свойств как раз и определяются слабыми типами химических связей (такими как водородные, различного типа донорно-акцепторные взаимодействия и пр.), на которые кардинальным образом может влиять изменение температуры и, следовательно, изменение атомной структуры биологических объектов. Следовательно, экспериментальные данные не вполне адекватно характеризуют геометрию комплексов и электронную структуру биологических молекул. Лишь теоретические методы исследования, к которым относятся и неэмпирический молекулярно-динамический расчет, позволяют в настоящее время получить более достоверную информацию о геометрии таких комплексов и изменениях их электронной структуры в биологических системах.

 

Реакции окисления протекают в биологических мембранах при участии ферментов класса оксидоредуктаз под общим названием цитохромы, которые организованы в специализированные редокс-цепи. Ряд вопросов относительно механизмов подобного рода реакций остается открытым, и проведение молекулярно-динамических расчетов при физиологической температуре способствует формированию полной картины этого сложного биохимического процесса. Данный метод нашел широкое применение в последние годы, причем не только классический [Shaitan K.V. et al. (1994-20000], но и неэмпирический [Car R, Parinello M. (1985), Bloechl P.E., Parinello M. (1992)]. Как классический, так и квантовый метод молекулярной динамики справедливы только для определенного электронного состояния (адиабатическое приближение). Но в классическом методе численно решаются уравнения Ньютона, и основная проблема состоит в выборе потенциалов взаимодействия, а в квантовом методе энергия взаимодействия находится в процессе расчета для каждой атомной конфигурации из решения уравнения Шредингера. В частности в одном из квантовых подходов, а именно методе Кара и Паринелло, одновременно рассчитываются ионы и электроны, причем ионы рассматриваются в классическом приближении, а электроны - в квантово-механическом [Валуев А.А., Каклюгин А.С., Норман Г.Э., 1995].

 

Выбор кластерных моделей для исследования электронной структуры и динамики атомного остова активных центров гемопротеинов

 

Молекулы гемопротеинов, как  уже подробно описано выше, это белки, построенные из сотен аминокислот. Чаще подобные структуры состоят из нескольких субьединиц как например молекула гемоглобина или цитохрома а. Отдельные участки белка имеют b-складчатое строение, а другие представляют собой a-спираль.. Но активным центром такой огромной молекулы является гем, состоящий из 36 атомов. Именно его электронная и атомная структуры отражают лигандсвязывающую и электронтранспортную активность всей молекулы. Лишь несколько аминокислот, ковалентно связанных с углеродами, находящимися на периферии протопорфиринового кольца, а также аминокислоты, связанные непосредственно с железом гема имеют определенное влияние на степень функциональной активности гемопротеинов. Остальная же аминокислотная цепь благодаря водородным связям и силам гидрофобного взаимодействия поддерживает уникальную конформацию данной белковой молекулы, которая находится либо в цитоплазме клетки, либо встроена в клеточную мембрану. Изучая электронную и атомную структуру активного центра такой макромолекулы нецелесообразно рассчитывать ее полностью, достаточно остановиться на собственно геме и 4-5 аминокислотах, с ним связанных (или достаточно близко с ним локализованных). В тоже время, расчеты электронной структуры гема без учета его аминокислотного окружения упрощают задачу, но при этом значительно снижают ценность получаемых результатов, поскольку подобные структуры в животных и растительных клетках не существуют.

 

Изучение процессов электронного и протонного транспорта в дыхательной цепи требует реконструкции отдельных участков, состоящих из молекул ферментов, встроенных в мембрану митоходрии. В этом случае огромное количество аминокислотных остатков, молекул липидов и углеводов формируют собой остов, поддерживающий небольшой участок молекулы цитохрома, где локализован активный центр (не более 70-100 атомов). Но и в этом случае не учитывать конформацию всего фермента невозможно, поскольку именно ей обусловлена доступность лигандов к активному центру гема и его пространственная локализация относительно активного центра следующего фермента в цепи переноса электронов.

 

Проводить квантово-химические расчеты такого класса объектов возможно, используя подход послойного выделения нескольких расчетных зон (методы QM/MM и ONIOM). Гем и его ближайшее аминокислотное окружение, а именно аминокислоты, координированные атомом железа в 5-ом и 6-ом положении (не более 150 атомов), рассчитываются или в ab initio подходе, или одним из вариантов метода DFT. Ковалентно связанные с остатками первого слоя аминокислоты рассчитываются полуэмпирически, а вся остальная молекула - молекулярной механикой (Рис.7). Наиболее ответственный момент - выбор аминокислот ближайшего окружения гема. Мы  применяем следующий критерий: если любой из атомов аминокислотного остатка удален от любого из атомов плоскости гема на расстояние менее 10Å, то выделяется весь остаток.

 

 

Важный момент при работе с молекулами гемоглобина и цитохромов Р-450 - учет аминокислотного  "кармана" (Рис.8), через который лиганд проникает к активному центру. Здесь возможно применить только визуальный критерий. Учет кармана имеет ключевое значение для адекватного расчета электронной структуры и динамики атомного остова изучаемых объектов, поскольку именно он определяет функциональную активность молекулы, а именно - потенциальную возможность вхождения того или иного лиганда.

 

 

 

 

 

Атомная и электронная структура гема с кислородом и оксидом азота

 

Методика расчетов

 

Геометрию построенных молекулярных структур оптимизировали методом Polak-Ribiere с точностью 0,001  ккал/моль. Квантово-химические расчеты проводили полуэмпирическим методом РМ3 и методом неэмпирической молекулярной динамики.

 

Атомное строение комплексов

 

Полуэмпирические квантово-химические расчеты методом РМ3 проводились без ограничения по симметрии объектов при этом порфириновое кольцо в процессе оптимизации геометрии приобретало форму «седла», а отсутствие лиганда в 6-ом положении усиливало такой эффект Нами были рассчитаны комплексы гема с His в 5-ом координационном положении (проксимально относительно плоскости) и молекулами О₂  и NO в шестом (дистально относительно плоскости.

 

Молекула NO, как и молекула О₂, координирована под углом к плоскости гема через атом азота (рис.9). Изменение межатомного расстояния при исследовании геометрии комплексов позволяет судить об изменении силы химической связи. Согласно нашим расчетам, расстояние между Fe и азотом имидазольного кольца His практически не отличалось как при связывании гемом кислорода, так и оксида азота. Но межатомное расстояние в самой молекуле лиганда  значимо менялось (таб. 1). Так, расстояние между атомами в молекуле кислорода при связывании с гемом возрастало на 0,046 Å, в то время как, межатомное расстояние в молекуле NO на 0,064 Å, что указывает на более прочную химическую связь между NO и Fe гема.

 

Таблица 1

Геометрическая структура комплексов гема с His и лигандами в шестом координационном положении

 

Примечание: здесь и далее: О1 и О2 - атомы молекулы кислорода, N_ак - атом азота имидазольного кольца His.

 

 

 

Эффективные атомные заряды комплексов гема с лигандами (таб. 2)

 

Заряд железа в комплексе гема с О₂ существенно выше, чем в комплексе с NO. Атом кислорода, координированный с железом гема, имеет положительный заряд, и соизмерим с зарядом атома азота в комплексе с NO.

 

Таблица 2

Заряды атомов кислорода  и оксида азота  в комплексе с железом гема

 

 

Исходя из значений суммарного заряда молекулы лиганда можно сделать вывод, что молекула кислорода поляризуется, т.к. ее суммарный заряд близок к нулю, в то же время в молекуле NO он приблизительно равен + 0,3, что указывает на значительное перераспределении заряда с NO на порфириновую плоскость. Следовательно, молекула NО связана с железом гема ковалентно, а между кислородом и Fe формируются лишь слабые ион-дипольные взаимодействия.

 

Электронное строение

 

Структуры верхних заполненных и нижних вакантных орбиталей комплексов гема с молекулой O₂ и NO в основном сформированы p-орбиталями атомов углерода и азота порфиринового кольца. Доли остальных атомных орбиталей, участвующих в формировании данных молекулярных орбиталей относительно малы (результаты не представлены). Замена кислорода на оксид азота приводит к увеличению вклада d-орбиталей в верхнюю заполненную и нижнюю вакантную орбиталь Fe, что в свою очередь также указывает на более прочное взаимодействие Fe с NO, чем с O_2. (таб. 3).

 

Таблица 3

Электронная структура верхней заполненной и нижней вакантной молекулярных орбиталей в комплексах гема с лигандами

 

Примечание: % -парциальные вклады d-орбиталей Fe в молекулярные орбитали комплексов

 

Реакционная способность комплексов зависит, в частности, от величины энергетической щели (DE) или энергетического расщепления между верхней заполненной и нижней вакантной орбиталями. Чем меньше величина этой щели, тем выше реакционная способность комплекса, что связано с уменьшением энергии возбуждения системы при переходе электрона с верхней заполненной на нижнюю вакантную орбиту. Большей реакционной способностью, согласно нашим расчетам, обладают комплексы гема с NO (таб.3).

 

 

 

Результаты молекулярно-динамических расчетов (heme_His_NO_md.hin, heme_Gly_NO_md.hin, heme_Gly_O2_md.hin, heme_Cys_O2_md.hin)

 

Проведение молекулярно-динамических расчетов с учетом температуры (310К) показало, что существенно меняется не только эффективная геометрия комплексов (в среднем на 0,06Å) (таб. 4), но и заселенность р-орбиталей атомов углерода и азота порфиринового кольца.

 

Таблица 4

Атомная геометрия комплексов с учетом температуры

 

Примечание: приведены максимальные и минимальные значения по каждому массиву данных, полученных в ходе молекулярно-динамических расчетов (310К). В скобках указаны углы и расстояния оптимизированных структур, полученных в ходе квантово-химических расчетов (при 0 К).

 

В комплексах гема с NO под действием температуры меняются относительные вклады p-орбиталей атомов азота и кислорода лиганда (NO), d-орбиталей железа (рис.10). На данном рисунке представлена электронная структура стоп-кадров динамического кино смоделированного при температуре 310К. Пик соответствует верхней заполненной орбитали. Стоп-кадры генерировали с шагом 0,01 пс., при этом получали мгновенные атомные координаты для которых в дальнейшем и была рассчитана электронная структура. Видно, что при температуре 310К меняются парциальные вклады d_z2 - орбиталей в ее плотность. А в комплексе гема с О₂ таких изменений во вкладах и положении d-орбиталей не наблюдалось.

 

 

 

Таким образом, получены следующие результаты:

 

1. Энергетическая щель в комплексах гема с NO в 1.5 раза меньше, чем в комплексах с O₂, что говорит о большей реакционной способности первых.

2. В комплексах гема с O₂, орбитали атомов лиганда дают небольшой вклад в верхнюю заполненную и нижнюю вакантную орбитали, в то время как, в комплексах с NO орбитали атомов лиганда существенно замешиваются в молекулярные орбитали комплекса, при этом неспаренный электрон молекулы NO переходит на d-орбиталь железа, формируя конфигурацию d⁷, а сама молекула оксида азота приобретает положительный заряд. Следовательно, молекула NO испытывает более сильное химическое связывание с гемом, нежели молекула O₂ и константа диссоциации также должна быть значительно выше.

3. Физиологическая температура (310К) оказывает существенное влияние на эффективную геометрию комплексов и  вызывает перераспределение электронной плотности d-орбиталей железа и p-орбиталей лиганда NO, что должно влияет на реакционную способность комплекса.

 

Координированный в 5-ом положении к железу гема гистидин играет ведущую роль в функционировании гемо (мио-)глобина и замена его на другую аминокислоту оказывает значимое влияние на лигандсвязывающую и каталитическую активность молекулы. В геме цитохромов, которые играют роль переносчиков электронов, атом железа также координирует в 5-ом положении атом азота имидазольного кольца. Но в дополнение к этому он координирует в 6-ом положении атом серы метионина, (в цитохромах с и b), цистеина (в цитохроме Р-450 [Guengerich F.P., 2000]), либо атом имидазольного кольца гистидина (в бактериохлорофилле Rsp. Viridis  и цитохроме b₅ [Карякин А. В., Арчаков А. И., 1981; Скулачев В. П., 1989].

 

Роль этих аминокислот становится очевидной при изучении свойств мутантных форм гемопротеинов. Так при замене в результате направленного мутагенеза проксимального Нis в миоглобине на глицин на Cys - значительно повышается способность к гетеролитическому расщеплению О-О связи в гидропероксиде кумола. При замене дистального His на Gly или Val карман становится гидрофобным, что затрудняет вхождение в него полярной молекулы Н₂О₂, хотя эффективность расщепления О-О практически не меняется [Watanabe Y., 1996].

 

Сравнение электронной и атомной структур комплексов мутантных по гистидину в 5-ом координационном положении форм гема с кислородом и оксидом азота дало следующие результаты.

 

Геометрия комплексов

 

В работе были рассчитаны комплексы гема с His, Gly и Cys в пятом координационном положении и молекулами кислорода и оксида азота в шестом. Молекула кислорода координируется комплексом гема с His под углом к плоскости гема, тогда, как в комплексе с Cys – параллельно. Расстояние от атома железа до ближайшего атома кислорода молекулы О₂ в комплексе с His составляет 1,815 Å, а в комплексе с Cys фактическое расстояние до молекулы кислорода существенно меньше – 1,706 Å из-за способа ее координации (рис. 11). При образовании химической связи по донорно-акцепторному механизму решающим является кратчайшее расстояние до молекулы лиганда.

 

 

Следовательно, комплекс гема с His слабее удерживает молекулу кислорода, чем гем-Cys. Косвенно, этот вывод подтверждается и существенным увеличением межъядерного расстояния аминокислота - комплексообразователь при замене His на Cys (1,881 Å и 2,451 Å  соответственно).

 

Усиление химической связи молекулы кислорода с гем-Cys, как следствие, приводит к существенному ослаблению химической связи кислород-кислород, о чем можно судить по заметному увеличению соответствующего межъядерного расстояния (таб. 5). Значительное повышение способности к гетеролитическому расщеплению О-О связи в мутантной по цистеину молекуле миоглобина [Watanabe Y., 1996], вполне может быть связано с такого рода изменениями атомной структуры комплекса.

 

Межъядерные расстояния в комплексе гем-Gly с кислородом явным образом указывают, что молекула О₂  существенно менее устойчива, чем в комплексе с His и Cys (таб. 5), чему имеются экспериментальные подтверждения.

 

Таблица 5

Геометрическая структура комплексов гема с аминокислотами и лигандами в шестом координационном положении

 

Примечание: N (S)_ак  – атом азота (серы) соответствующей аминокислоты, координированный к железу гема; в комплексах гем-Cys  гем-Gly с кислородом в скобках указаны фактические расстояния до молекулы О₂, а не до ее атомов.

 

Расчеты энергии связи лигандов подтверждают сделанные по анализу межъядерных расстояний выводы (таб.6).

 

Таблица 6

Энергия связи в комплексе гем-аминокислота с кислородом

 

 

Молекула NO координирована атомом азота под углом к плоскости гема. Судя по межъядерному расстоянию (таб.5) наиболее устойчивый комплекс формируется между NО и железом гема при замене His на Cys, но сама аминокислота связана слабо (как и в случае с кислородом) и межъядерное расстояние в молекуле лиганда больше, т.е. NO становится несколько менее устойчивым. Замена His на Gly понижает, как и в случае с кислородом,  степень связывания молекулы NО с гемом.

 

Эффективные атомные заряды комплексов гема с лигандами

 

Присоединение лиганда по донорно-акцепторному механизму к железу гема (как О₂ так и NO) приводит к изменению формального заряда атома Fe, рассчитанному по Малликену. При этом электронная плотность с р-орбиталей лиганда перемещается на вакантные d-орбитали железа, которое приобретает отрицательный заряд. Этот артефакт, по-видимому, связан с тем, что у кислорода (как, впрочем, и у NO) на несвязывающих орбитах находится существенный электронный заряд (орбитали заполнены), которые в комплексе формально начинают относится к d-орбиталям железа.

 

В комплексе гем-His с О₂ этот формальный отрицательный заряд железа существенно выше, чем в комплексе с NO (таб. 7). Атом кислорода, координированный с железом гема, имеет положительный заряд, как и заряд атома азота в комплексе с NO, а второй атом кислорода - отрицательный. Исходя из значений суммарного заряда молекулы лиганда можно сделать вывод, что молекула кислорода поляризуется, т.к. ее суммарный заряд близок к нулю, в то же время в молекуле NO он приблизительно равен +0,3, что указывает на значительное перераспределении заряда с NO на порфириновую плоскость. Следовательно, молекула NО связана с железом гема ковалентно, а между кислородом и Fe формируются лишь слабые ион-дипольные взаимодействия [Романова Т.А., Краснов П.О., Аврамов П.В., 2001]. При этом, не зависимо от лиганда (О₂, NO), электронная плотность на азоте имидазольного кольца His значительно понижается.

 

Таблица 7

Эффективные атомные заряды

 

 

 

 

В комплексе гем-Cys, молекула кислорода практически не поляризуется, а электронная плотность, судя по изменению заряда железа, смещается на координируемый атом серы. Такой же характер носит смещение электронной плотности с железа  и в комплексах гем-Cys, с оксидом азота.

 

Анализ зарядов на атомах показывает, что характер химического связывания молекулы кислорода в комплексах с Cys и Gly аналогичны и принципиально отличаются от такового в случае с His.

 

Таким образом, при совместном анализе экспериментальных данных и квантово-химических расчетов мы видим, что аминокислота гистидин играет ключевую и уникальную роль в лигандсвязывающих свойствах гема.

 

Далее были проведены сравнительные теоретические исследования электронной структуры аминокислот координирующихся в 5-ом и 6-ом положении с железом гема и других аминокислот, входящих в состав белковой цепи.

 

В формировании координационной связи аминокислоты с железом гема принимают участия  р-орбитали атома азота или серы (у цистеина и метионина). Природа верхней заполненной молекулярной орбитали (ВЗМО) определяет прочность этой химической связи. Сравнение плотности р-состояний в ВЗМО атома лиганда (либо одного из атомов азота, либо атома серы), позволило выяснть, что уникальной аминокислотой  в этом смысле является гистидин. Для него характерна максимальная плотность р-состояний координирующегося атома азота по сравнению с другими аминокислотами (таб.8).

 

Таблица 8

Плотности р-орбиталей атомов азота аминокислот

 

 

 

 

Так, если у гистидина плотность р-состояний азота имидазольного кольца, которым и происходит координация 0,93 (относительные единицы) (рис. 12), то у аргинина, также двуосновной аминокислоты все атомы азота практически эквивалентны и относительная плотность любого из атомов в среднем равна 0,60 (рис. 13).

 

 

 

Азот индола триптофана, по структуре наиболее близкого к гистидину, имеет плотность р-состояний в ВЗМО равную 0,26 (рис.14). За счет столь высокой электронной плотности р-состояний в ВЗМО, гистидин может формировать более прочную донорно-акцепторную связь с комплексообразователем, которым, в данном случае, выступает атом железа порфиринового кольца.

 

 

Очевидно, что биохимические реакции, как правило, характеризуются минимальными энергетическими эффектами. Это связано с тем, что для молекулярных биологических структур весьма важной характеристикой является их конформация, которая определяется, в основном, слабыми водородными связями. Естественно предположить, что высокие энергетические эффекты (или барьеры активации) способны необратимо менять конформацию белковых структур. В процессе электронного транспорта гем цитохрома принимает или отдает электрон, фактически изменяя степень окисления железа, а это – достаточно серьезные изменения в электронной структуре активного центра системы. Относительно нивелировать этот эффект можно насыщением химической связи максимальным количеством электронов (так называемый р-электронный буфер). Этому требованию в наибольшей степени удовлетворяет аминокислота гистидин, так как она характеризуется максимальным вкладом р-орбиталей азота в ВЗМО и, тем самым, максимальной емкостью р-электронного буфера, которая препятствует значительному изменению параметров химической связи в процессе электронного транспорта гемами.

 

Особая роль в функционировании цитохромов принадлежит серосодержащим аминокислотам (метионин и цистеин). Несмотря на то, что плотность р-состояний такая же как и у гистидина (рис. 15, 16), константа устойчивости комплексных соединений с серой ниже.

 

 

 

Таким образом, основной критерий для аминокислот, которые координируются в 5-ом и 6-ом положении с железом гема это их р-электронный буфер, поскольку в процессе функционирования гемопротеинов, в частности цитохромов, меняется степень окисления железа, что обеспечивает электронный транспорт. Относительная стабильность молекулярной системы в таком случае обеспечивается минимальными изменениями в ее электронной структуре. Следовательно, величина р-электронного буфера координирующих аминокислот играет ведущую роль. Среди всех аминокислот максимальные значения определены для гистидина и серосодержащих метионина и цистеина. Именно эти аминокислоты и координируются с железом гема цитохромов ЭТЦ и Р-450, причем максимальную электронную подвижность обеспечивает сера.

 

 

 

 

 

ЛИТЕРАТУРА К ПРИЛОЖЕНИЮ 1

1.        Коттон Ф., Уилксон Дж. Основы неорганической химии // М.: Мир, 1979,  677 с.

2.        Ленинджер А. Биохимия: Молекулярные основы структуры и функции клетки, М.: Мир, 1974 г., 957с 

3.        Степанов В. М. Молекулярная биология. Структура и функции белков // М.: Высшая школа, 1996, 335 с.

4.        Скулачев В. П. Энергетика биологических мембран // М.: Наука», 1989, 565 с.

5.        Реутов В. П., Сорокина Е. Г.   NO-синтазная и нитритредуктазная компононты цикла оксида азота .. Биохимия.  1998,  Т. 63, вып. 7,  1029 - 1040.

6.        Fucuto J. M. The conversion of arginine to citruline and notric oxide by nitric oxide synthase // 11^th Int. Symp. Microsomes and Drug. Oxid., Los Angeles, Calif, 1996, p. 48.

7.        Rousseau D. L. Substrste-ligand interaction in nitric oxide synthase // 11^th Int. Symp. Microsomes and Drug. Oxid., Los Angeles, Calif, 1996, p. 50.

8.        Недоспасов А. А. Биогенный NO в конкурентных отношениях // Биохимия, 1998, т. 63, вып. 7, с. 881-904.

9.        Хаценко О. Взаимодействие оксида азота и цитохрома Р-450 в печени // Биохимия, 1998, т. 63, вып. 7, С. 984-991.

10.     Карякин А. В., Арчаков А. И. Межмембранный перенос электронов // Успехи современной биологии, 1981, Т. 91, вып. 1, с. 74-89.

11.     Щербаков В.М., Тихонов А.В. Изоформы цитохрома Р-450 печени человека - М.: АО “Биохимические технологии”, 1995, 102 с.

12.     Guengerich F.P. Common and uncommon cytochrome P450 reaction related to metabolism and chemical toxicity // Chem. Res. Toxicol., Published on Web 00/00/000 Pege est: 39.7

13.     Finean J. B., Coleman R., Michell R.H. Membrane and their cellular functions // Blackwell Scientific Publications, 1984, 227 p.

14.     Henry Y., Guissani A. Les metalloproteins, cibes cellulares du monoxyde d’azote: Une revue succincte // C. R. Seanse Soc. boil., 1955, 189, N 6, p. 1039-1057.

15.     Okada Sh., Takehara Y., Yabuki M., et al. Nitric oxide a physiological  modulator of mitochondrial function // Physiol. Chem and Phus and Med NMR., 1996, 28, N 2, р. 69.

16.     Lin Z., Miao M., Wang X., Zhu Ch. Endogenosus nitric oxide on mitochondial  oxigen consumption after cerebal ischemic reperfusion // J. Med. Coll. PLA.,  1997,  12,  N. 3,. р. 196-199.

17.     Bates T. E., Loesh A., Burnstick G., Clarc J. B. Motichondrial nitric oxode sinthase: A ubiquitous regulator of oxidative phosphorilation? // Bioch. And Biophys. Res. Comm.,  1996,   218,  N 1,  р. 40-44.

18.     Тэйлор Б. С., Аларсон Л. Х., Биллиар Т. Р. Индуцибельная синтаза оксида азота в печени: регуляция и функции // Биохимия, 1998, т. 63, вып. 7, с. 905-923.

19.     Watanabe Y. Roles of amino acid residues around heme on the formation of high valent intermediates // 11^th Int. Symp. Microsomes and Drug. Oxid., Los Angeles, Calif, 1996, p. 84.

20.     Boffi A., Chiancone El., Takahashi S., Rousseau D. L. Stereochemistry of the Fe(II)- and Fe(III)-cyanide complexes of the homodimeric Scapharca inaequivavalvis hemoglobin. A resonance Raman and FTIR stady // Biochemistry, 1997,  36,  N.15,  p. 4505-4509.

21.     Doussiere J., Gaillard J., Vignais P.  Electron transfer across the O2- generating flavocytochrome b of neutrophils. Evidence for a transition from a low-spin state to a high-spin state of the heme iron component // Biochemistry, 1996, 35,  N. 41,  р. 13400-13410.

22.     Rousseau D. L. Substrste-ligand interaction in nitric oxide synthase // 11^th Int. Symp. Microsomes and Drug. Oxid., Los Angeles, Calif, 1996,. p. 50.

23.     Abu-Soud H. M., Wu Ch., Ghosh D. K., et al.  Stopped-flow analis of CO and NO binding to inducible nitric oxide synthase // Biochemistry,  1998, 37,  N 11, p. 3777 – 3786.

24.     Бышевский А. Ш., Терсенов О. А. Биохимия для врача // Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. – 384 с.

25.     DePillis G. D., Decatur S. M., Barrick D., Boxer S. G. // J. Am. Chem. Soc. 1994. Т. 116. Р. 6981-6982.

26.     Schmidt M.W., Baldridge K.K., Boatz J.A., Elbert S.T., Gordon M.S., Jensen J.H., Koseki S., Matsunaga N, Nguyen K.A., Su S.J., Windus T.L, Dupuis M.,. Montgomery J.A.  // J. Comp. Chem., 1993, V.14, р.1347-1363.

27.     Романова Т.А., Краснов П.О., Аврамов П.В. Электронная структура комплексов гема гемоглобина с лигандами и динамика их атомного остова при физиологической температуре Электронный журнал "Исследовано в России", 781-791, 2001, http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/070.pdf.

28.     Romanova T., Krasnov P. Modification of electronic structure of heme under formation of complex with nitric oxide and dynamics of atomic base under physiological temperature // Abstract 4^th International conference on biological physics, July 30-August 3, 2001, Kyoto, Japan, p. 113.

29.     Романова Т.А., Краснов П.О., Аврамов П.В. Электронная структура комплекса гема гемоглобина с оксидом азота и динамика атомного остова при физиологической температуре // Вопросы медицинской химии, 2001, т. 47, в. 3, с. 308-315.

30.     Романова Т.А., Краснов П.О., Аврамов П.В Изменение электронной структуры гема при образовании комплекса с оксидом азота и динамика атомного остова при физиологической температуре // Доклады академии наук, 2001, т. 380, № 2, с. 319-622.